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A multiplicação dos fragmentos de DNA

Ocorrendo a fragmentação das moléculas de DNA, com o uso das enzimas de restrição, e o seu reconhecimento pela técnica de eletroforese em gel, o próximo passo é multiplicar (clonar) o fragmento obtido e submetê-los à tecnologia do DNA recombinante. A técnica de multiplicação da fita de DNA é chamada de PCR (reação em cadeia da polimerase).

Na década de 1980, passou-se a utilizar a técnica do PCR para fazer milhares de cópias de um único pedaço de DNA. Essa técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários, como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a replicação do DNA).

Os primers são fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares, isto é se ligam por complementaridade ao início da sequência de DNA que se quer multiplicar.  Quando uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a dupla fita, formando assim duas fitas diferentes mas complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a duplicação, por isso, precisamos de dois tipos de primers diferentes (veja a figura)

 

Técnica de PCR, passo a passo

Obtém-se uma amostra mínima de DNA de uma célula humana.

 
  1. A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA polimerase), os nucleotídeos de DNA e os primers complementares a sequência de DNA são colocados em um tubo de ensaio.
  2. Coloca-se o tubo de ensaio em uma máquina de PCR (máquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa). Os passos seguintes, de aquecimento e resfriamento, acontecem dentro da máquina controlados pelo programa.
  3. Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar (separar a dupla fita) o DNA.
                

          4. Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias               complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam ao início das duas               fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase.

          5. Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA polimerase)              para a duplicação da fita. A DNA polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os              nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma              nova fita dupla.

 

 

 

 

 

 

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